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?微生物組測序是否需要設置生物學重復，生物學重復的意義是什么，一般設置多少個？
為了實驗設計的嚴謹、分析結果可靠、投稿順利，微生物組測序需要設置生物學重復。
生物學重復能夠能可以測量變異程度，夠消除組內誤差；降低背景差異，增強結果的可靠性；檢測離群樣本，異常樣本的存在，會嚴重影響測序結果的準確性，通過計算樣本間的相關性可以發現異常樣本，將其排除。
自然環境至少3個生物學重復，一般推薦5個；若是人類的腸道、糞便等樣品，由于個體特異性高，建議10個以上的重復。 -
?微生物多樣性測序與宏基組測序樣品準備及樣品郵寄注意事項
微生物多樣性測序與宏基因組測序均需準備DNA樣品。
微生物多樣性DNA送樣要求：
DNA樣品總量：單次建庫的量m≥0.25μg，建議送2次建庫的量，即m≥0.5μg；
DNA樣品濃度：c＞5ng/μl，以Qubit質檢結果為準；
DNA樣品純度：OD260/280在1.8~2.0之間；
DNA樣品完整性：DNA無降解，即電泳有明顯的主條帶。
宏基因組DNA送樣要求：
DNA樣品總量：單次建庫的量m≥2.5μg，建議送2次建庫的量，即m≥5μg；
DNA樣品濃度：c＞100ng/μl，以Qubit質檢結果為準；
DNA樣品純度：OD260/280在1.8~2.0之間；
DNA樣品完整性：DNA無降解，即電泳有明顯的主條帶。
樣品郵寄時，應使用干冰或冰袋運送DNA樣品，保證DNA樣品的完整性。 -
?16S測序如何選擇合適的測序區域？
調查文獻發現16S測序會選擇單V區（V4區）、雙V區（V3-V4區或V4-V5區）以及三V區（V1-V3區、V4-V6區），但是并沒有定論說測哪個區域更好。銳翌基因選擇V3-V4區進行測序，原因有幾下幾點：引物序列設計覆蓋率高；目標區域中已知物種種類較多；目標區域中物種測定準確率高；測序儀器讀長限制。
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?宏基因組測序時，如何去除宿主污染？
取樣時，盡量避免取到宿主部位；
DNA提取時，盡量去除雜質；
數據分析時，進行宿主數據庫的比對，去除宿主污染的序列信息。 -
?什么是Q20和Q30？
高通量測序中，每測一個堿基會給出一個相應的質量值，這個質量值用于衡量測序準確度。堿基的質量值為20，錯誤率為1%，30的錯誤率為0.1%。Q20與Q30則表示質量值大于等于20或30的堿基所占百分比。比如一共測了1G的數據量,其中有0.9G的堿基質量值大于或等于20,那么Q20則為90%。
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?什么是N50和N90？
將宏基因組denovo組裝的序列按長度從大到小的順序排序，依次累加序列的長度，當累加值第一次超過所有序列總長度的50%(90%)時，此時累加到的序列的長度值即為N50(N90)。相比序列平均長度，N50(N90)更能準確表示此次序列拼接的效果。
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?擴增子與宏基因組的區別？
擴增子測序指16S、18S、ITS測序，主要用于研究環境樣品中微生物的組成，性價比高，實用性強；宏基因組主要用來研究環境樣品中的微生物組成、基因組成、功能基因等信息，深度挖掘環境樣品潛在的功能。
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?16S與宏基因組在微生物多樣性分析的差異
數據庫不同。16S使用的數據庫是Sliva、Greengene或RDP數據庫；宏基因組使用的是NCBI數據量；鑒定到不同水平上的物種的種類是不同的。16S在門、綱、目、科、屬水平注釋上的物種均多于宏基因組，而宏基因組僅在種水平注釋上的物種組成顯著多于16S。
